聚焦GB 4789.9-2025弯曲菌检验：关键步骤操作要点与高效解决方案

1. 称量与稀释：准确称取25g（果蔬、水产品除贝类取50g）样品，加入装有100mL无菌0.1%蛋白胨水的带滤网均质袋中。

2. 均质与过滤：使用拍击式均质器以规定力度均质1-2分钟，使样品充分破碎、菌体释放。随后通过均质袋自带的滤网，将匀浆过滤至无菌离心管中，以去除大颗粒杂质。

3. 离心富集：将滤液在4℃、12000g条件下离心15分钟，弃去上清。此步骤可重复以充分富集目标菌体。

4. 重悬：用1mL无菌生理盐水重悬沉淀，取全部悬浮液加入9mL弯曲菌增菌液中。

5. 增菌培养：将弯曲菌增菌液置于微需氧环境（85%N₂, 10%CO₂, 5%O₂）中，42℃±1℃培养24h±2h。

   
   

关键控制点：

1. 精准定量稀释： 样品称量及稀释步骤的准确性直接影响后续增菌效果的可比性。推荐使用HD-DT系列自动样品稀释仪，该仪器通过精密天平自动称量样品，根据称量结果和设置的稀释比例，自动计算需要加的稀释液，并控制精密泵加装稀释液，操作简便，为后续增菌环节的均一性与可靠性奠定坚实基础。

2. 均质效率：均质的充分与否直接决定菌体释放率。推荐使用HD-H15拍打式均质器，其拍击间距、速度与时间可调，能针对不同食品基质的特性进行优化，确保均质效果均一、高效。

3. 低温离心：全程需在4℃环境下操作，保持弯曲菌的活性。

4. 无菌操作：过滤、转移、重悬等步骤需严格无菌，防止交叉污染。

5. 微需氧环境精准控制：这是成功分离的关键。弯曲菌对氧气敏感，而传统的微需氧培养方法（如产气袋、手套箱）普遍存在“操作繁琐"、“气体消耗大"、“环境难控"等问题。

   推荐采用HD-AN系列智能厌氧/微需氧培养系统，可一键自动抽排置换气体，快速、精确地建立并维持5%氧气浓度的环境，且配套培养罐可脱机使用，衔接培养与转运流程。

HD-AN系列 智能厌氧/微需氧培养系统

   滤膜培养法，是新标准为提升空肠弯曲菌和结肠弯曲菌分离选择性而引入的重要技术。其原理是利用0.45μm孔径的滤膜，允许体型纤细、具有特殊螺旋运动的弯曲菌通过，而大部分杂菌则被截留，从而显著提高目标菌的检出率。

（1）前期准备

1. 用无菌镊子将0.45μm无菌滤膜平整贴附于哥伦比亚血琼脂平板和卡玛丽血琼脂平板中央，确保无气泡。

（2）过滤操作

1. 取300μL经42℃微需氧增菌24小时后的培养物，分4-6小滴滴加在滤膜上（勿超出滤膜边缘）。

2. 在室温下静置45-60分钟（微需氧或普通气体环境），让菌液充分渗透，期间切勿移动滤膜。

3. 用无菌镊子小心移除滤膜。

（3）培养与观察

1. 将平板立即翻转，置于微需氧环境中，42℃±1℃培养24-48小时。

2. 培养24-48小时后，在两种平板上寻找分散凸起、边缘整齐发亮的可疑菌落（卡玛丽平板上呈淡灰色，表面湿润有金属光泽；哥伦比亚平板上呈灰白色，湿润有光泽）。

关键提示：

1. 必须保证足够的液体渗透时间，时间不足可能导致细菌无法穿过滤膜。

2. 操作全程需严格无菌，微需氧环境的快速建立与稳定维持是方法成功的关键，直接影响目标菌的复苏与生长。

（1）可疑菌落纯培养

1. 从滤膜法培养后的平板上，挑取至少5个（不足5个则全挑）典型可疑菌落，分别划线接种至新的哥伦比亚血琼脂平板，以获得单菌落。

2. 置于微需氧环境中，42℃±1℃培养24-48小时。

（2）革兰氏染色与镜检（形态观察）

1. 挑取纯培养后的单个菌落，严格按照标准流程进行革兰氏染色，随后油镜观察。

2. 判定：弯曲菌属应为革兰氏阴性杆菌，菌体形态典型者可见S形、螺旋形或海鸥展翅状（部分菌株形态可能不典型）。

（3）氧化酶试验

1. 用非铁质接种环（如铂金环或一次性塑料环）挑取菌落，涂抹于被氧化酶试剂浸湿的滤纸上。

2. 判定：在10秒内，涂抹点出现紫红色、紫罗兰色或深蓝色，即为阳性。

（4）有氧条件下25℃生长试验

1. 挑取菌落接种至哥伦比亚血琼脂平板，置于普通有氧环境中，25℃±1℃培养48小时。

2. 判定：培养后无菌生长为符合弯曲菌属特性（阳性结果）。

关键控制点：

1. 确保获得纯培养物，这是所有后续鉴定试验准确的前提。

2. 染色结果的清晰、准确至关重要，是排除其他革兰氏阳性杂菌干扰的第一步。

   推荐使用HD-GM100全自动革兰氏染色仪，提升鉴定流程的标准化、安全性与效率。

• 标准化染色流程：仪器自动完成涂片、固定、染色、脱色、复染及干燥全流程，确保每张玻片染色效果高度一致，消除人工操作差异。

• 高效批量处理：支持连续批量处理样本，一键启动即可自动运行，显著提升实验室检测通量，解放人力。

• 安全与质量保障：封闭式操作有效减少试剂暴露和交叉污染风险；标准化输出确保染色质量稳定，菌体形态清晰易辨，结果可追溯。

3. 氧化酶试验中必须使用非铁质工具，避免铁离子导致假阳性；严格计时观察。

   在获得弯曲菌属的可疑菌落后，标准中允许使用微生物生化鉴定系统替代传统的过氧化氢酶、马尿酸钠水解、吲哚乙酸酯水解试验等单项试验，进行种水平的鉴定与确认。

1. 菌悬液制备：挑取纯培养的可疑菌落，配制为符合系统要求浊度的菌悬液。

2. 试剂板接种：将菌悬液接种至专用生化鉴定试剂板（如革兰氏阴性菌鉴定板或特定弯曲菌鉴定板）的微孔中。

3. 培养与读数：将试剂板放入微生物生化鉴定系统配套的孵育仓/判读器中，在适宜条件下培养一定时间（通常4-24小时）。

4. 自动分析与报告：系统通过自动感光比色及矩阵概率算法，读取生化反应结果，并与内置数据库比对，自动给出菌种鉴定结果及置信度。

   推荐使用HD-MT系列细菌麦氏浊度仪用于制备标准麦氏浊度的菌悬液，为细菌鉴定提供样品质量保证。

HD-MT系列 细菌麦氏浊度仪

   此外，HD-MA系列自动微生物生化鉴定及药敏系统配套的专用试剂板与数据库，可准确鉴定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌及其它常见微生物，极大提升了鉴定效率与标准化水平。

HD-MA系列自动微生物生化鉴定及药敏系统

1. 标准化与高通量：此方法将多项繁琐的手工试验集成于一块试剂板，实现了标准化和高通量操作。

2. 结果客观：避免了人工判读的主观误差，结果更客观、可追溯。

   新标准在传统生化鉴定基础上，明确新增了实时荧光PCR与MALDI-TOF MS作为种水平鉴定（区分空肠弯曲菌与结肠弯曲菌）的确证方法，为实验室提供了更高效、更精准的鉴定路径。

   PCR方法可在数小时内获得高特异性结果，是快速筛查与确证的理想选择。

1. DNA模板制备（热裂解法）：挑取1-3个纯培养菌落，悬浮于500μL无菌去离子水中，100℃水浴/金属浴加热10分钟，冰浴或室温短暂冷却后，8000-13000g高速离心10min取上清即为DNA模板。

2. PCR反应体系配制：严格按标准配制反应体系，需包含针对cj0415基因（空肠弯曲菌）和zupT基因（结肠弯曲菌）的特异性引物与探针。

3. 上机扩增：将反应管置于实时荧光PCR仪中，运行标准程序（94℃预变性30秒；随后94℃变性5秒、60℃退火延伸30秒，循环40次）。

4. 结果判读：根据FAM和VIC通道的Ct值及扩增曲线，判断是否检出目标基因。

关键控制点：

1. 防污染：PCR实验需在独立分区进行，严格防止气溶胶污染。

2. 对照设置：必须同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，确保结果有效。

   弯曲菌属内不同菌种的鉴定对于弯曲菌感染的防控和治疗具有重要意义，针对不同菌种的PCR技术，手动配制反应体系繁琐且易出错。因此迫切需要一种能够快速、准确、广谱鉴定弯曲菌属内菌种的方法。

   推荐使用弯曲菌六重核酸检测试剂盒（探针法）等商品化试剂盒。该方案将多重PCR检测与内标监控集成于单管单次反应中，不仅符合国标引物探针序列要求，还简化了操作，极大地提升了检测通量与效率。

   弯曲菌六重核酸检测试剂盒（探针法）可用于包括弯曲菌属、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、红嘴鸭（海鸥）弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌以及胎儿弯曲菌的检测及鉴定。

  本试剂盒包含弯曲菌六重检测液A、弯曲菌六重检测液B、弯曲菌六重阳性对照、阴性对照，采用多重实时荧光PCR技术，对同一样本采用A、B两个三重荧光PCR反应检测、鉴定是否含有重要的食源性弯曲菌属内菌种，同时确定菌种是空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、红嘴鸭（海鸥）弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌或者胎儿弯曲菌。

   MALDI-TOF MS通过分析微生物独特的蛋白质指纹图谱进行鉴定，是新国标推荐的另一项前沿技术，能将鉴定时间缩短至分钟级。

1. 靶板样本制备：

• 直接涂抹法：将少量纯培养菌落直接均匀涂抹于质谱靶板点样位。

• 甲酸提取法（推荐）：在菌落涂抹处加1μL 70%甲酸，干燥后再覆盖1μL基质溶液（如HCCA）。

2. 上机检测：将靶板放入质谱仪，仪器自动进行激光轰击、数据采集。

3. 数据库比对与鉴定：系统将采集的蛋白谱图与内置数据库进行比对，给出最可能的菌种鉴定结果及置信度评分。

   
   

关键控制点：

1. 样本前处理一致性：前处理方法是影响谱图质量的关键，需标准化。

2. 数据库完整性：数据库是否涵盖目标菌种直接影响鉴定能力。

HD-M-Discover系列

微生物质谱快速鉴定分析系统

   为满足新国标对MALDI-TOF MS方法的应用要求，HD-M-Discover系列微生物质谱快速鉴定分析系统提供了强大的技术支撑：

1.  优异性能，稳定可靠

   系统搭载高性能固体激光器与新一代控制芯片，确保激光发射稳定、靶板定位精准，保障仪器在各类实验室环境下长期稳定运行。

2.  精准鉴定，技术先进

   依托“基因+蛋白+AI"三重技术，系统内置全新升级的菌种质谱图数据库及智能算法，对空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等食源性致病菌的鉴定准确率显著提升，并能有效识别罕见菌。

3.  极速高效，流程智能

• 高速检测：单样本检测可低至6秒，整板（96样本）最快10分钟即可完成全自动鉴定，实现从“小时级"到“分钟级"的效率飞跃。

• 全流程自动化：实现从样本上机到结果输出的一键式操作。硬件状态实时监控与自动报警，最大限度减少人为误差与操作门槛。

• 数据深度挖掘：除快速鉴定外，系统支持主成分分析、聚类分析等功能，为菌株同源性分析与疫情溯源提供强大数据支持。

青岛中创汇科试剂

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